南京理工大學電光學院陳錢、左超教授團隊在計算光學顯微成像領域重要研究進展

 

　　光學顯微鏡作為生命科學、醫(yī)學和材料科學等領域的核心觀測工具。然而受拉格朗日不變量等因素的制約，在傳統(tǒng)顯微鏡中分辨率和成像視場之間存在固有的權衡。隨著生物醫(yī)學領域的基礎研究和前沿技術的不斷進步，對能夠實現(xiàn)跨尺度、高通量顯微成像的需求日益增長，但傳統(tǒng)顯微鏡普遍無法兼顧分辨率和視場的雙重要求。
 

　　計算光學顯微成像技術如合成孔徑全息術、傅里葉疊層顯微術和無透鏡片上顯微術等發(fā)展迅速，為高通量成像提供了新方案。無透鏡片上顯微術無需透鏡，避免視場與分辨率矛盾，在細胞生物學、病理篩查、藥物篩選等領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力。但生物細胞和組織的三維結構難以用二維透射率函數(shù)表征，光學衍射層析成像技術更適合厚樣品。目前，無透鏡片上層析成像研究較少，多采用機械光束掃描或多光源陣列照明。傾斜照明會導致衍射圖樣移位和畸變，大角度照明下數(shù)據(jù)丟失，影響成像分辨率。因此，如何實現(xiàn)全視場超分辨成像是當前面臨的一大挑戰(zhàn)。
 

　　針對上述問題，南京理工大學陳錢、左超教授研究團隊提出了一種基于波長掃描傅里葉疊層衍射層析技術(wavelength-scanning Fourier ptychographic diffraction tomography，簡稱wsFPDT)的新型無透鏡片上三維顯微成像技術，通過波長掃描的照明調控方式實現(xiàn)三維散射勢的頻譜填充。與基于多角度照明的無透鏡三維成像方法相比，該技術不會引入圖像移位、畸變等問題，實現(xiàn)了全視場分辨準均勻、無標記、高通量的衍射層析成像。
 

　　圖1. 基于wsFPDT無透鏡片上三維成像的基本思想。 (a) 光學實驗裝置示意圖。(b) 實驗過程示意圖。(c) wsFDPT重建原理。

 

　　研究團隊搭建了無透鏡片上三維衍射層析成像的顯微硬件系統(tǒng)(圖1a)，采用單色板級傳感器記錄原始強度圖，使用超連續(xù)譜光源結合聲光可調濾波器進行波長掃描照明。自主開發(fā)C++控制軟件實現(xiàn)聲光可調諧濾波器與傳感器同步觸發(fā)，可在6秒內(nèi)完成圖像采集。然后基于傅里葉疊層重建算法對欠采樣的衍射圖樣重復迭代約束直至收斂，再進行非負約束和全變分正則化相結合的混合約束處理，獲得樣品像素超分辨的三維折射率分布(圖2)。
 

圖2. wsFPDT方法重構算法流程圖。
 

　　為了驗證wsFPDT技術在全視場范圍內(nèi)實現(xiàn)高通量三維成像的能力，對傾斜USAF分辨率靶標進行實驗，結果如圖3a所示。基于上述系統(tǒng)，wsFPDT獲得了775 nm橫向分辨率和5.43 μm軸向分辨率，超越CMOS傳感器像素尺寸(1.67 μm)采樣限制的2.15倍。進一步地，將選定的USAF靶標圖案分別水平放置在傳感器的中心和邊緣位置并重復實驗(圖3b-c)，可以得到近乎相同的成像結果，表明wsFPDT技術能夠提供全視場內(nèi)準均勻的成像分辨率。此外，傾斜的USAF靶標被懸空放置，致使其離焦距離相較緊貼傳感器放置時要遠離200 μm以上，這說明wsFPDT方法在不犧牲橫向成像分辨率的情況下，能夠實現(xiàn)超過200 µm的有效成像深度，該成像深度要比傳統(tǒng)的基于透鏡的光學衍射層析技術高出5到10倍。圖4展示了wsFPDT方法對兩種硅藻進行三維重建的結果，從中可以清晰看到硅藻殼的三維骨架結構及其內(nèi)部復雜的細節(jié)信息，該實驗進一步證明了wsFPDT方法在處理較厚且具有復雜軸向結構樣品的三維層析能力。
 

　　圖3.相位分辨率靶標的實驗結果。(a) 傾斜放置的分辨率靶標的實驗裝置設計和重建結果。(b-c) 選定的靶標放置在傳感器不同位置的成像結果對比。

 

圖4. C. hibernicus和Naviculold兩種硅藻的實驗結果。
 

　　圖5展示了wsFPDT對無標記小鼠單核巨噬細胞高通量三維成像的結果。wsFPDT可以對全視場(29.85 mm2)內(nèi)所有細胞同時實現(xiàn)定量三維折射率的重建，重建結果包含約18.3億有效體素，視場范圍覆蓋約32,000個巨噬細胞?；谒@得的三維折射率分布，可實現(xiàn)對每個細胞的形態(tài)學參數(shù)(如體積、面積和球形度等)精確的定量分析。實驗結果不僅驗證了wsFPDT針對大量未染色細胞集群的高通量三維成像方面的能力，還展示了其在單細胞層面進行定量分析的潛力，將為研究細胞的結構特征及其對內(nèi)部和外部刺激(如滲透壓和藥物治療)的反應提供重要的統(tǒng)計數(shù)據(jù)支持。該方法有望為大規(guī)模細胞分析、高內(nèi)涵精準篩選等方面提供重要的影像學支撐，并在高通量藥物研發(fā)和無標記病理分析等領域具有重要的應用前景。
 

圖5. 小鼠單核巨噬細胞的全視場三維成像。
 

　　上述工作得到了國家重點研發(fā)計劃(2022YFA1205002, 2024YFE0101300)，基金委國家重大科研儀器研制項目(62227818)，江蘇省基礎研究計劃前沿引領專項(BK20192003)等資助。