PCR/RT-PCR還有不懂的？看這篇！

1. 問(wèn)題： RT-PCR 靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒(méi)有 RT-PCR 產(chǎn)物。

可能原因：
1 ） RNA 被降解 ( 如何確定 RNA 是否被講解，詳見(jiàn)前 “ 植物 RNA 的提取 ” 。
建議解決方法：
在用來(lái)驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析  RNA 使用良好的無(wú)污染技術(shù)分離 RNA ；在將組織從動(dòng)物體取出后立刻處理在 100 ％甲酰胺中儲(chǔ)存 RNA ；如果使用胎盤(pán) RNase  抑制劑，不要加熱超過(guò) 45 ℃ 或 pH 超過(guò) 8.0 ，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的 RNase 。而且，在 ≥0.8mM DTT 時(shí)加入  RNase 抑制劑，一定要存在 DTT 。

2 ） RNA 中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑
建議解決方法：
通過(guò)乙醇沉淀 RNA 除去抑制劑。用 70 ％（ v/v ）乙醇對(duì) RNA 沉淀進(jìn)行清洗?？梢约尤胩窃?0.25μg 到 0.4μg/μl ）以幫助小量樣品 RNA 的恢復(fù)。
逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括： SDS ， EDTA ，甘油，焦磷酸鈉， spermidine ，甲酰胺和胍鹽。
將對(duì)照 RNA 同樣品混合，同對(duì)照 RNA 反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢驗(yàn)抑制劑。

3 ）多糖同 RNA 共沉淀
建議解決方法：
使用氯化鋰沉淀 RNA 以除去多糖。 自己的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)： 一般用乙酸鈉就可以出去多糖，但是要用 70 ％乙醇洗 2-3 次除鹽。

4 ）用于合成 cDNA 第1鏈合成的引物沒(méi)有很好退火建議解決方法：
確定退火溫度適合您的引物。對(duì)于隨機(jī)六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在 25 ℃ 保溫 10 分鐘。
對(duì)于基因特異性引物（ GSP ），可以試一下其他 GSP ，或換用 oligo(dT) 或隨機(jī)六聚體 . 確定 GSP 是反義序列。

5 ）起始 RNA 量不夠
建議解決方法：
增加 RNA 量。
對(duì)于＜ 50ng 的 RNA 樣品，可以在第1鏈 cDNA 合成中使用 0.1μg 到 0.5μg 乙酰 BSA 。

6 ） RNA 模板二級(jí)結(jié)構(gòu)太多
建議解決方法：
將 RNA 和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性 / 退火 . 提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，對(duì) SuperScript Ⅱ 可以到 50 ℃ ，對(duì) ThermoScript 可以到 65 ℃ 。
注意：不要在＞ 60 ℃ 時(shí)使用 oligo(dT) 引物，選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的 GSP 。對(duì)于＞ 1kb 的 RT-PCR 產(chǎn)物，保持反應(yīng)溫度 ≤65℃ 。
注意：不要在高于 37 ℃ 時(shí)使用 M-MLV 。
如果不需要全長(zhǎng) cDNA ，在第1鏈反應(yīng)中使用隨機(jī)引物。

7 ）引物或模板對(duì)殘余的 RNA 模板敏感
建議解決方法：
在 PCR 前用 RNaseH 處理。

8 ）靶序列在分析的組織中不表達(dá)
建議解決方法：
嘗試其他靶序列或組織

9 ） PCR 沒(méi)有起作用
建議解決方法：
對(duì)兩步法 RT-PCR ，不要在 PCR 步驟中使用超過(guò) 1/5 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物。

2. 問(wèn)題： PCR 靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒(méi)有 RT-PCR 產(chǎn)物。

可能原因：
1 ） PCR 引物設(shè)計(jì)較差
建議解決方法：
避免在引物 3' 端含有互補(bǔ)序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計(jì) Tm 類(lèi)似的引物。

2 ） DNA 含有抑制劑
建議解決方法：
諸如 DMSO ， SDS 和甲酰胺之類(lèi)的試劑會(huì)抑制 Taq DNA 聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀 DNA 。

3 ）富含 GC 的模板
建議解決方法：
對(duì)于 GC 含量＞ 50 ％的模板，使用 PCRx Enhancer Solution 。

4 ）模板濃度太低
建議解決方法：
使用 104 拷貝的靶序列，以在 25 到 30 個(gè)循環(huán)中獲得信號(hào)。

5 ）鎂離子濃度太低
建議解決方法：
從 1mM 到 3mM ，間隔 0.5mM 進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì)的最jia鎂離子濃度。注意：對(duì)實(shí)時(shí)定量 PCR ，使用 3mM 到 5mM 的鎂離子濃度。

6 ）退火溫度太高
建議解決方法：
使用表 4 的公式估算 Tm ，把退火溫度設(shè)定為低于 Tm 5℃ 。因?yàn)檫@些公式只是估算 Tm 值，所有真正的退火溫度實(shí)際會(huì)高些或低些。

7 ）引物濃度太低
建議解決方法：
最jia引物濃度介于 0.1μM 到 0.5μM 之間。為了精que確定引物濃度，在 260nm 測(cè)量光密度，然后使用光吸收值和消光系數(shù)計(jì)算濃度。

3. 問(wèn)題： RT-PCR 特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預(yù)期條帶。

可能原因：
1 ）物和模板非特異性退火
建議解決方法：
在第1鏈合成中使用 GSP ，而不是隨機(jī)引物或 oligo(dT) 。

試用允許高溫 cDNA 合成的 GSP 。
2 ） GSP 設(shè)計(jì)較差
建議解決方法：
遵循用于擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)的同樣原則

3 ） RNA 中沾染了基因組 DNA 建議解決方法：
使用擴(kuò)增級(jí) DNase Ⅰ 處理 RNA 。使用沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反應(yīng)檢測(cè) DNA 污染。

4. 問(wèn)題： PCR 特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預(yù)期條帶。

可能原因：
1 ）形成引物二聚體
建議解決方法：
設(shè)計(jì)在 3' 端沒(méi)有互補(bǔ)序列的引物。

2 ）引物和模板非特異性退火
建議解決方法：
以 2 ℃ 到 5 ℃ 間隔增加退火溫度，減少退火時(shí)間。
在開(kāi)始幾個(gè)循環(huán)使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度。
使用 Platinum Taq DNA 進(jìn)行自動(dòng)熱啟動(dòng) PCR 。
避免在引物 3' 端含有 2 到 3 個(gè) dG 或 dC 。

3 ）鎂離子濃度太高
建議解決方法：
對(duì)于每一個(gè)模板和引物組合優(yōu)化鎂離子濃度。

4 ）因?yàn)閿U(kuò)增復(fù)雜模板導(dǎo)致引物錯(cuò)誤起始
建議解決方法：
使用巢式 PCR 或遞減 PCR 。

5 ）沾染外源 DNA 建議解決方法：
使用抗氣霧劑的 tip 和 UDG 。

6 ）因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)無(wú)法接近
建議解決方法：
對(duì)于 GC 含量＞ 50 ％的模板，使用（ 1×-3× ） PCRx Enhancer Solution 。

5. 問(wèn)題： PCR 忠實(shí)性： PCR 在產(chǎn)物序列中引入了錯(cuò)誤可能原因：

1 ）聚合酶忠實(shí)性低
建議解決方法：
使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如 Platinum Pfx DNA 聚合酶。

2 ）循環(huán)數(shù)太多
建議解決方法：
降低循環(huán)數(shù)。

3 ）四種 dNTP 的濃度不同
建議解決方法：
制備新的 dNTP 混合物，保-證四種核苷濃度相同。使用預(yù)混合物